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定量逆转录和聚合酶链反应

Posted: Wed Feb 19, 2025 8:59 am
by aminaas1575
低温能量过滤 410 和 430 Phillips 透射电子显微镜配备后柱、电子能量损失谱仪 (EELS) 和能量色散 X 射线谱仪 (EDXS) (Noran,美国威斯康星州米德尔顿)。场发射扫描电子显微镜 SEM1530(Zeiss,德国,奥伯科亨)配备能量色散 X 射线光谱仪 (EDXS)(Noran,美国,威斯康星州米德尔顿)。场发射扫描电子显微镜 3400 配备能量色散 X 射线光谱仪 (EDXS)(日立,日本,东京)。 S2 Picofox XRFS 光谱仪配备有钼 (Mo) X 射线靶和珀尔帖冷却的 Xflash 硅漂移探测器(Bruker AXS,美国威斯康星州菲奇堡)。扫描时间长达1000秒。将 1000 mg/L ICP 单元素镓或钆标准品(CPI International,美国科罗拉多州丹佛市)加入到 500 µL 的每个样品中,最终浓度为 10 mg/L。使用 SPECTRA 7 软件(Bruker AXS,美国威斯康星州菲奇堡)进行仪器控制、数据采集和分析。
使用 TRIzol(MRC,美国俄亥俄州辛辛那提)分离总 RNA。以RNA为模板,利用随机六聚体和逆转录酶(ABI,加利福尼亚州福斯特城,美国)通过逆转录生成cDNA。 GAPDH 和肌动蛋白转录本作为对照(ABI,美国加利福尼亚州福斯特城)。它们是在 380A DNA 合成仪(ABI,美国加利福尼亚州福斯特城)上合成的。 PCR 反应使用 cDNA、合成 约旦手机号码数据 引物、dNTP 和 Taq DNA 聚合酶(Hoffmann - La Roche,Basel,H)的混合物在 Robocycler(Stratagene,加利福尼亚州圣地亚哥,美国)、Mastercycler(Eppendorf,德国汉堡,欧盟)和 7500 或 7900 系统(ABI,加利福尼亚州福斯特城,美国)上进行。使用荧光成像仪(美国加利福尼亚州桑尼维尔市 Molecular Dynamics 公司)或 Storm 840 公司(英国白金汉郡 Amersham 公司)采集并定量电泳扩增子的图像。所有转录本水平均标准化为 GAPDH 或肌动蛋白。然后计算出研究患者细胞中转录物浓度与健康对照组织和培养物细胞中转录物浓度的比率。

免疫印迹
将细胞和组织冷冻并切碎,或使用超声波发生器(美国康涅狄格州丹伯里 Branson Ultrasonic)将其分解,然后在样品缓冲液中均质化。它们储存在液氮中,并在天然缓冲液(Invitrogen,美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)中进行电泳。它们在真空下或通过电转移到 PVDF 膜上(Amersham,白金汉郡,英国,欧盟)。携带转移蛋白质的膜首先浸泡在人血清中,然后用生物工程抗体进行标记。纯化的 CD34、CD117、CD133 和心脏肌球蛋白作为对照。使用荧光成像仪 (Molecular Dynamics,美国加利福尼亚州桑尼维尔) 或 Storm 840 (Amersham,英国白金汉郡,欧盟) 捕获并量化印迹图像。